(AGENPARL) - Roma, 29 Novembre 2023[lid] Utilizzando etichette fluorescenti che si accendono e spengono, gli ingegneri del MIT possono studiare come le molecole in una cellula interagiscono per controllarne il comportamento.
Le cellule viventi sono bombardate da molti tipi di segnali molecolari in arrivo che influenzano il loro comportamento. Essere in grado di misurare tali segnali e il modo in cui le cellule rispondono ad essi attraverso reti di segnalazione molecolare a valle potrebbe aiutare gli scienziati a imparare molto di più su come funzionano le cellule, compreso ciò che accade quando invecchiano o si ammalano.
Al momento, questo tipo di studio completo non è possibile perché le attuali tecniche per l’imaging delle cellule sono limitate a solo una manciata di diversi tipi di molecole contemporaneamente all’interno di una cellula. Tuttavia, i ricercatori del MIT hanno sviluppato un metodo alternativo che consente loro di osservare fino a sette molecole diverse alla volta, e potenzialmente anche di più.
“Ci sono molti esempi in biologia in cui un evento innesca una lunga cascata di eventi a valle, che poi provoca una specifica funzione cellulare”, afferma Edward Boyden, professore di Neurotecnologie a Y. Eva Tan. “Come avviene ciò? È senza dubbio uno dei problemi fondamentali della biologia, e quindi ci siamo chiesti: potresti semplicemente guardarlo accadere?”
Il nuovo approccio fa uso di molecole fluorescenti verdi o rosse che si accendono e si spengono a velocità diverse. Immaginando una cellula per diversi secondi, minuti o ore e quindi estraendo ciascuno dei segnali fluorescenti utilizzando un algoritmo computazionale, è possibile monitorare la quantità di ciascuna proteina bersaglio mentre cambia nel tempo.
Boyden, che è anche professore di ingegneria biologica e di scienze cerebrali e cognitive al MIT, ricercatore dell’Howard Hughes Medical Institute e membro del McGovern Institute for Brain Research e del Koch Institute for Integrative Cancer Research del MIT, nonché del co- direttore del K. Lisa Yang Center for Bionics, è l’autore senior dello studio, pubblicato oggi su Cell . Yong Qian, postdoc del MIT, è l’autore principale dell’articolo.
Segnali fluorescenti
L’etichettatura delle molecole all’interno delle cellule con proteine ??fluorescenti ha permesso ai ricercatori di imparare molto sulle funzioni di molte molecole cellulari. Questo tipo di studio viene spesso condotto con la proteina fluorescente verde (GFP), utilizzata per la prima volta per l’imaging negli anni ’90. Da allora, diverse proteine ??fluorescenti che brillano di altri colori sono state sviluppate per uso sperimentale.
Tuttavia, un tipico microscopio ottico può distinguere solo due o tre di questi colori, consentendo ai ricercatori solo una piccola occhiata dell’attività complessiva che avviene all’interno di una cellula. Se potessero tracciare un numero maggiore di molecole marcate, i ricercatori potrebbero misurare la risposta di una cellula cerebrale a diversi neurotrasmettitori durante l’apprendimento, ad esempio, o studiare i segnali che inducono una cellula tumorale a metastatizzare.
“Idealmente, saresti in grado di osservare i segnali in una cellula mentre fluttuano in tempo reale, e quindi potresti capire come si relazionano tra loro. Questo ti direbbe come calcola la cella”, dice Boyden. “Il problema è che non puoi guardare molte cose contemporaneamente.”
Nel 2020, il laboratorio di Boyden ha sviluppato un modo per visualizzare simultaneamente fino a cinque diverse molecole all’interno di una cellula, indirizzando i reporter luminosi in posizioni distinte all’interno della cellula. Questo approccio, noto come “ multiplexing spaziale ”, consente ai ricercatori di distinguere i segnali di diverse molecole anche se potrebbero essere tutte fluorescenti dello stesso colore.
Nel nuovo studio, i ricercatori hanno adottato un approccio diverso: invece di distinguere i segnali in base alla loro posizione fisica, hanno creato segnali fluorescenti che variano nel tempo. La tecnica si basa su “fluorofori commutabili” – proteine ??fluorescenti che si accendono e si spengono a una velocità specifica. Per questo studio, Boyden e i membri del suo gruppo hanno identificato quattro fluorofori verdi commutabili, e poi ne hanno ingegnerizzati altri due, che si accendono e si spengono a velocità diverse. Hanno inoltre identificato due proteine ??fluorescenti rosse che cambiano a velocità diverse e hanno progettato un ulteriore fluoroforo rosso.
Ciascuno di questi fluorofori commutabili può essere utilizzato per marcare un diverso tipo di molecola all’interno di una cellula vivente, come un enzima, una proteina di segnalazione o una parte del citoscheletro cellulare. Dopo aver fotografato la cellula per diversi minuti, ore o addirittura giorni, i ricercatori utilizzano un algoritmo computazionale per individuare il segnale specifico da ciascun fluoroforo, analogamente a come l’orecchio umano può individuare diverse frequenze del suono.
“In un’orchestra sinfonica ci sono strumenti acuti, come il flauto, e strumenti bassi, come la tuba. E nel mezzo ci sono strumenti come la tromba. Hanno tutti suoni diversi e il nostro orecchio li distingue”, dice Boyden.
La tecnica matematica utilizzata dai ricercatori per analizzare i segnali dei fluorofori è nota come linear unmixing. Questo metodo può estrarre diversi segnali di fluorofori, in modo simile a come l’orecchio umano utilizza un modello matematico noto come trasformata di Fourier per estrarre diverse altezze da un brano musicale.
Una volta completata l’analisi, i ricercatori possono vedere quando e dove ciascuna delle molecole marcate con fluorescenza è stata trovata nella cellula durante l’intero periodo di imaging. L’imaging stesso può essere eseguito con un semplice microscopio ottico, senza la necessità di attrezzature specializzate.
Fenomeni biologici
In questo studio, i ricercatori hanno dimostrato il loro approccio etichettando sei diverse molecole coinvolte nel ciclo di divisione cellulare, nelle cellule dei mammiferi. Ciò ha permesso loro di identificare modelli nel modo in cui i livelli di enzimi chiamati chinasi ciclina-dipendenti cambiano man mano che una cellula progredisce attraverso il ciclo cellulare.
I ricercatori hanno anche dimostrato di poter etichettare altri tipi di chinasi, che sono coinvolte in quasi ogni aspetto della segnalazione cellulare, nonché strutture cellulari e organelli come il citoscheletro e i mitocondri. Oltre ai loro esperimenti utilizzando cellule di mammifero coltivate in una capsula da laboratorio, i ricercatori hanno dimostrato che questa tecnica potrebbe funzionare nel cervello delle larve di pesce zebra.
Secondo i ricercatori, questo metodo potrebbe essere utile per osservare come le cellule rispondono a qualsiasi tipo di input, come nutrienti, fattori del sistema immunitario, ormoni o neurotrasmettitori. Potrebbe anche essere usato per studiare come le cellule rispondono ai cambiamenti nell’espressione genica o alle mutazioni genetiche. Tutti questi fattori svolgono un ruolo importante nei fenomeni biologici come la crescita, l’invecchiamento, il cancro, la neurodegenerazione e la formazione della memoria.
“Si potrebbe considerare tutti questi fenomeni come una classe generale di problemi biologici, in cui alcuni eventi a breve termine – come mangiare una sostanza nutritiva, imparare qualcosa o contrarre un’infezione – generano un cambiamento a lungo termine”, afferma Boyden.
Oltre a perseguire questo tipo di studi, il laboratorio di Boyden sta anche lavorando per espandere il repertorio di fluorofori commutabili in modo che possano studiare ancora più segnali all’interno di una cellula. Sperano anche di adattare il sistema in modo che possa essere utilizzato nei modelli murini.
La ricerca è stata finanziata da una Alana Fellowship, K. Lisa Yang, John Doerr, Jed McCaleb, James Fickel, Ashar Aziz, il K. Lisa Yang e Hock E. Tan Center for Molecular Therapeutics del MIT, l’Howard Hughes Medical Institute e gli Istituti Nazionali di Sanità.
Didascalia:I ricercatori del MIT hanno sviluppato un metodo che consente loro di osservare fino a sette molecole diverse alla volta, e potenzialmente anche di più.
Crediti:Credito: iStock, Christine Daniloff, MIT